µ-NOTAS

Tinción de Gram: principio, procedimiento e interpretación

μ- NOTA 2

By Víctor Deroncelé

Hey μlegas, en esta μnota hablaremos de la tinción de GRAM. Una técnica que revolucionó el campo de la microbiología y que, desde 1884, sigue siendo utilizada en los laboratorios de micro para visualizar bacterias al microscopio óptico.

En esta técnica la clave está en que el microorganismo sea capaz de retener o no un colorante, el violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana. Las bacterias Gram positivas aparecen teñidas de morado, mientras que las Gram negativas son rosas. La diferencia entre unas y otras radica en la composición de la pared celular y su permeabilidad.

El nombre cristal violeta procede de una traducción errónea del nombre en inglés crystal violet, siendo la traducción correcta violeta cristal.

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1- Principio

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa delgada de peptidoglicano y una membrana externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y permite diferencial estos dos grupos de bacterias.

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Fig. 1. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram negativas y Gram positivas¹

La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario violeta cristal, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del violeta cristal por la formación de un complejo violeta cristal-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo violeta cristal-yodo^1,2.

2- Reactivos

Violeta cristal, colorante primario.
Lugol, mordiente.
Mezcla decolorante (alcohol:acetona)
Safranina, contratinción.

3- Técnica de coloración:

Cubrir el extendido con Violeta para Gram. Dejar actuar 30-60 segundos.
Lavar con agua corriente durante 10 segundos.
Cubrir con Lugol. Dejar 30-60 segundos.
Lavar con agua corriente durante 10 segundos.
Cubrir con Decolorante para Gram. Decolorar durante 10 segundos.
Lavar con agua corriente 10 segundos.
Cubrir con Safranina para Gram.
Dejar 30-45 segundos.
Lavar con agua corriente durante 10 segundos.
Secar el extendido.

4- Interpretación de los Resultados:

Cubrir el extendido con una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio óptico, con un aumento 1000X

Gram Positivas: Azul/Purpura/violáceo
Gram Negativas: Rosado-rojizo

Casi todos los microorganismos pueden ser detectados por este método excepto las clamidias, los micoplasmas, ureaplasmas y las espiroquetas

Ver animación pinchando en el enlace: Tinción de GRAM

5- Referencias:

López-Jácome LE, Hernández-Durán M, Colín-Castro CA, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en discapacidad. 2014;3(1):10-18.
Popescu A, Doyle RJ. The Gram stain after more than a century. Biotechnic & histochemistry. 1996;71(3):145-151.