Prueba del Indol

μ- NOTA 22

By Víctor Deroncelé

Desde finales del sXIX, la prueba del indol se utilizaba para distinguir entre Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. Las numerosas variaciones de la prueba de indol sola y en combinación con otras pruebas bioquímicas atestiguan el papel central que ha desempeñado esta prueba en la caracterización de coliformes (μ- NOTA 5). La prueba de indol todavía se utiliza como prueba clásica para distinguir E. coli, positiva para indol, de Enterobacter y Klebsiella, indol-negativas.

La prueba del indol demuestra la capacidad de ciertas bacterias para descomponer el triptófano en indol, que se acumula en el medio. La prueba de producción de indol es importante en la identificación de enterobacterias (μ- NOTA 4). La mayoría de las cepas de especies de E. coli, P. vulgaris, P. rettgeri, M. morgani y Providencia descomponen el aminoácido triptófano con la liberación de indol. Esto lo realiza una cadena de varias enzimas intracelulares diferentes, un sistema generalmente denominado \»triptofanasa\». Se utiliza como parte de los procedimientos IMViC, una prueba diseñada para distinguir entre miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fig. 1: Una reacción positiva se evidencia por la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio (capa alcohólica).

Se genera el indol por una desaminación reductiva del triptófano via la molécula intermediaria ácido indolpirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

En esta prueba se produce un producto coloreado cuando el indol se combina con ciertos aldehídos. Específicamente, en la prueba el indol se combina con el reactivo de Kovac (que contiene ácido clorhídrico y p-dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico), la solución cambia de amarillo a rojo cereza (rojo violeta). Debido a que el alcohol amílico no es soluble en agua, la coloración roja se formará en una capa aceitosa en la parte superior del caldo.

El principal requisito del medio para la prueba de indol es que contenga una cantidad suficiente de triptófano. Aunque muchos medios cumplen con este criterio, comúnmente se usa caldo triptona.  Si se utiliza un caldo de peptona en lugar de caldo triptona, el lote debe comprobarse con un control positivo para garantizar que la peptona sea adecuada para la producción de indol. Esto se debe a que existen variedades de medios de caldo de peptona en el mercado y algunos no son adecuados para la producción de indol porque contienen muy poco triptófano. Y, si los caldos peptonados contienen glucosa, no deberían ser usados para esta prueba, porque se produce ácido y este cambio de pH puede inhibir la producción de indol.

Se describen dos métodos de prueba de indol; una prueba puntual de indol, que detecta organismos productores rápidos de indol, y un método de tubo convencional que requiere incubación durante la noche, que identifica organismos productores de indol débiles

• Método de tubo convencional para la prueba de indol.

1. Se inocula el caldo triptona (o peptona) con el microorganismo y se incuba a 37ºC, durante 24-48 horas.
2. Se adicionan 0,5 mL del reactivo de Kovác. Se agita suavemente.
3. Observar la capa superior del líquido, luego de 1 minuto.

Nota: No se deben utilizar medios que contengan colorantes (p. ej., EMB, MAC). El medio de crecimiento debe contener una cantidad adecuada de triptófano. No utilice agar Mueller-Hinton para la prueba, porque el triptófano se destruye durante la hidrólisis ácida de la caseína.

Resultado positivo: Formación de un color rosado a rojo (que aparece a los pocos segundos).

Resultado negativo:  Sin cambio de color, la capa de reactivo permanece amarilla o ligeramente turbia.

• Prueba puntual de Indol (spot test).

1. Se coloca un trozo de papel de filtro (Whatman nº 1) en una placa de Petri estéril y se humedece con 1 -1,5 mL de reactivo de indol (p-metilaminobenzaldehído al 1% o p-dimetilaminocinamaledhído al 1%)
2. Se unta la superficie saturada del papel con una colonia (de un cultivo de 18 a 24 horas) usando un asa de siembra estéril

 Nota: Los microrganismos se toman a partir de un medio que contenga triptófano (ej. agar sangre), y nunca de medios como el agar Mac Conkey, que tienen indicadores de pH y las colonias lactosas positivas, son pigmentadas, lo cual puede dificultar la interpretación de los resultados.

1. Observar cambio de color.

Los colores resultantes dependen del reactivo de indol utilizado. Si se usa p-metilaminobenzaldehído, la presencia de indol se indica con un color rojo y si se usa p-dimetilaminocinamaledhído, se observa un color verde azulado.

Prueba de Indol positiva: Si dentro de 2 a 3 minutos desarrolla un color azul ( o rojo), indica un resultado positivo, lo que significa que el microorganismo tiene la capacidad de producir Indol.

Prueba de Indol negativa: Si no se produce un cambio de color, indica un resultado negativo, lo que significa que el organismo de prueba no tiene capacidad para producir indol.

Fig. 2: Prueba puntual del indol.  Imagen de: https://microbenotes.com/

Controles de la prueba:

• Positivo: Escherichia coli (ATCC25922)
• Negativo: Klebsiella pneumoniae (ATCC13883). Proteus mirabilis  NCTC 10975

Tabla 1: Ejemplos de microorganismos indol-positivos e indol-negativos.