Listeria monocytogenes

μ- NOTA 21

By Víctor Deroncelé

Listeria monocytogenes es el agente causante de la listeriosis humana, una enfermedad grave, especialmente peligrosa para los ancianos, las mujeres embarazadas y los recién nacidos. Aunque esta infección es comparativamente rara, a menudo se asocia con una tasa de mortalidad significativa, del 20 al 30% en todo el mundo. Por tanto, este microorganismo tiene un impacto importante en la seguridad alimentaria. L. monocytogenes puede adaptarse, sobrevivir e incluso crecer en una amplia gama de condiciones de estrés ambiental, encontrados con frecuencia en los diferentes eslabones de la cadena de producción de alimentos: frío (<0º C), calor (>50º C), acidez (pH>4,3) y salinidad (12% de cloruro sódico), radiación ultravioleta, presencia de biocidas y metales pesados. Además, esta bacteria también es capaz de formar estructuras de biopelículas en una variedad de superficies en entornos de producción de alimentos, lo que dificulta su eliminación y le permite persistir durante mucho tiempo. Todo esto aumenta el riesgo de contaminación de las instalaciones de producción de alimentos y finalmente de los alimentos.

Fig. 1:  Medios cromogénicos para el análisis de Listeria monocytogenes (https://www.biomerieux.es/ )

Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo no esporulado, aerobio y anaerobio facultativo, psicotrófico, crece entre -0.4°C y 45°C (temperatura óptima de crecimiento: 37°C)¹ y pH entre 4,6 y 9,5 (pH óptimo de crecimiento entre 7,2 y 7,6), posee movilidad por medio de 4 flagelos perítricos a 22°C y 28°C (posee una motilidad característica tipo “tumbling” o “volteo”, es decir, mediante un lanzamiento rápido combinado con saltos y rotación)  y  es inmóvil por encima de 30ºC (a 37°C solo forma un flagelo polar); produce listeriosina O (que es una exotoxina hemolítica y citolítica) y es resistente a altas concentraciones de cloruro de sodio (30%)².

Listeria monocytogenes podría subclasificarse en 13 serotipos según el antígeno O somático, todos los cuales podrían causar listeriosis, pero los serotipos 1/2b, 1/2a, 4b son más prevalentes. Los serotipos 4c, 4b, 3b, 1.2a, 1/2b se aíslan principalmente de productos alimenticios independientemente del tipo de matriz alimentaria, su capacidad de patogenicidad o las regiones geográficas. El serotipo 4b está estrechamente relacionado con la mayoría de los brotes.

Las colonias de Listeria monocytogenes son pequeñas, de 1 a 2 mm, lisas, emiten un ángulo de luz de 45°-60° por epiiluminación observándose reflejos de color azul-verdoso sobre una superficie finamente granular.

Las reacciones de Voges-Proskauer y rojo de metilo son positivas, hidroliza la esculina en pocas horas, pero no la urea ni la gelatina. No producen indol, ni ácido sulfhídrico (SH₂), producen ácido a partir de la D-glucosa (pero no gas) y de otros azúcares, el contenido de guanina-citosina de su ADN es bajo, entre el 36% y el 38%.

L. monocytogenes se aísla fácilmente de muestras orgánicas habitualmente estériles como sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, placenta y tejido fetal. Estas muestras clínicas suelen ser inoculadas directamente en medios como el agar sangre. En agar sangre L. monocytogenes crece produciendo colonias grisáceas y presentando beta hemolisis. Para el aislamiento de esta bacteria a partir de alimentos, las muestras tienen que ser enriquecidas previamente, ya que de lo contrario la ausencia de ésta en el alimento no descarta la presencia de la bacteria ya que puede estar en una baja concentración o encontrarse en condiciones de estrés y su recuperación se vería afectada.

Las técnicas fenotípicas utilizadas para la identificación de L. monocytogenes incluyen el aislamiento en medios selectivos y la posterior caracterización bioquímica y serológica.  Generalmente, para el aislamiento de L. monocytogenes se debe hacer un pre-enriquecimiento en caldo Fraser. Este caldo inhibe microorganismos gramnegativos, dado que contiene ácido nalidíxico, acriflavina y cloruro de litio. Todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, que reacciona con los iones férricos produciendo un ennegrecimiento del medio.  A partir de este caldo se siembran en placas de agar con medios selectivos/diferenciales que permitan el aislamiento de las colonias presuntivas de L. monocytogenes.

Los medios selectivos/diferenciales incluyen medios con esculina y medios cromogénicos:

A. Medios agarizados con esculina:

1. 1. Agar Oxford: En este medio, después de 24 h de incubación, a 35 °C, las colonias típicas de Listeria tienen aproximadamente 1 mm de diámetro, son de color gris a negro y están rodeadas por un halo negro. Después de 48 h de incubación, las colonias típicas de Listeria tienen aproximadamente 2-3 mm de diámetro, son negras con un halo negro y el centro hundido.
   2. PALCAM: Las condiciones de incubación y la apariencia de las colonias en este medio son similares a las descritas para el medio Oxford, salvo que el color de fondo de este medio es rojo.

B. Medios cromogénicos:

1. 1. Medio R&F®
   2. RAPID’L.mono™
   3. Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti, o Oxoid™ chromogenic Listeria agar (OCLA)
   4. CHROMagar™ Listeria

En la identificación de L. monocytogenes se utilizan procedimientos que incluyen:

1. Hemólisis. En agar sangre monocytogenes y L. seeligeri producen una zona betahemólisis alrededor de la colonia. L. innocua no muestra ninguna zona de hemólisis, mientras que L. ivanovii produce una zona clara bien definida alrededor de la colonia.
2. Movilidad: Su movilidad se evidencia en medios de cultivo semisólido donde a los 25 °C el microorganismo forma una especiede sombrilla.
3. Prueba de la catalasa: Las Listerias son catalasa-positivas
4. Tinción de GRAM: Todas las Listeria spp. son bacilos cortos grampositivos; que en cultivos más viejos pueden Gram-variables y también las células pueden aparecer esferoidales.
5. Fermentación de carbohidratos: Todas las Listeria spp. son positivas para dextrosa, esculina y maltosa. Todas las Listeria spp. excepto grayi son manitol-negativas.
6. Prueba de CAMP: monocytogenes es positivo con la siembra de S. aureus y negativo con la de R. equi.

Listeria monocytogenes es intrínsecamente resistente a las cefalosporinas (cefazolina, ceftiofur, cefpiroma), las quinolonas (ácido nalidíxico y las primeras fluoroquinolonas, como la ofloxacina), la fosfomicina y la clindamicina. Casi nunca se observa resistencia adquirida. La mayoría de cepas aisladas son susceptibles a la penicilina G, la amoxicilina, los aminoglucósidos (gentamicina), las tetraciclinas, los fenicoles, el trimetoprim y las sulfonamidas, la rimfampicina y los glucopéptidos (vancomicina)³.

Referencias.

1. Allerberger F. Listeria: growth, phenotypic differentiation and molecular microbiology. FEMS Immunology & Medical Microbiology 2003;35(3):183-189.
2. Bucur FI, Grigore-Gurgu L, Crauwels P, Riedel CU, Nicolau AI. Resistance of Listeria monocytogenes to stress conditions encountered in food and food processing environments. Frontiers in microbiology 2018;9:2700.
3. Granier SA, Moubareck C, Colaneri C, Lemire A, Roussel S, Dao T-T, Courvalin P, Brisabois A. Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolates from food and the environment in France over a 10-year period. Applied and Environmental Microbiology 2011;77(8):2788-2790.